突如其來的19新型冠狀病毒給國人的新年蒙上了一層陰影，一時(shí)間，醫(yī)生搶上陣，民眾搶隔離，今天筆者也搶一微文，和大家聊聊冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)。
針對(duì)冠狀病毒的檢測(cè)方法主要包括檢測(cè)病毒相關(guān)蛋白或患者體內(nèi)中和抗體的抗原-抗體法（主要為酶聯(lián)免疫法）、檢測(cè)病毒核酸的PCR法、病毒分離鑒定、芯片法等等，前兩者在臨床上具有較強(qiáng)的可操作性，應(yīng)用也最廣泛。酶聯(lián)免疫法和PCR法均具有較高的檢測(cè)準(zhǔn)確率，二者配合使用則可獲得更客觀的臨床診斷數(shù)據(jù)。但由于酶聯(lián)免疫法試劑盒的研制需要病毒相關(guān)蛋白的體外表達(dá)、純化及相應(yīng)抗體的制備，研制周期相對(duì)較長。而核酸檢測(cè)試劑盒的研制則更為快捷，只要知曉了病毒基因組序列，便可設(shè)計(jì)出相應(yīng)的擴(kuò)增引物，再與常規(guī)的PCR檢測(cè)試劑包裝成試劑盒便易如反掌。
猶記03年時(shí)，媒體還沒有如此發(fā)達(dá)，每天只能在電視新聞中聽聞今天又新增了幾例病例；技術(shù)也沒有如此先進(jìn)，臨床診斷還主要是采用血常規(guī)結(jié)合X射線胸片的方法，誤診率較高。全球首個(gè)SARS病毒血清抗原檢測(cè)試劑盒直至2003年的12月，也就是抗擊非典結(jié)束后半年才姍姍來遲。筆者在國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上查詢到，從2003年到2018年15年間，僅有8款針對(duì)冠狀病毒的檢測(cè)試劑盒獲批（表1），其中7款為國產(chǎn)酶聯(lián)免疫試劑盒，1款PCR-熒光探針法核酸檢測(cè)試劑盒。其中華大吉比愛生物技術(shù)有限公司的4款試劑盒檢測(cè)對(duì)象是患者體內(nèi)產(chǎn)生的SARS特異性IgM或IgG抗體，珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司的2款試劑盒則是針對(duì)SARS病毒的N-蛋白進(jìn)行檢測(cè)。值得注意的是，針對(duì)當(dāng)年SARS-coV檢測(cè)的最早的一款試劑盒也是疫情過去4個(gè)月后才獲批成功。
表1 2003-2018年獲批冠狀病毒檢測(cè)試劑盒
（數(shù)據(jù)來源：國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站）
時(shí)光流轉(zhuǎn)到2019年，當(dāng)冠狀病毒披著“新型鎧甲”卷土重來時(shí)，短短1個(gè)月余的時(shí)間內(nèi)國家藥監(jiān)局已審批通過了7款試劑盒（表2）。而已研制成功的試劑盒更是多達(dá)17種，涉及21家企業(yè)。體外診斷（IVD）公司的迅速反應(yīng)，體現(xiàn)了我國在疾病檢測(cè)領(lǐng)域的飛速發(fā)展。不僅如此，相關(guān)企業(yè)也在加足馬力對(duì)2019-coV的相關(guān)蛋白進(jìn)行體外表達(dá)純化并積極推進(jìn)著相關(guān)抗體的制備，預(yù)示著酶聯(lián)免疫試劑盒也即將問世。
表2 2020年獲批冠狀病毒檢測(cè)試劑盒
（數(shù)據(jù)來源：國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站）
相對(duì)于藥物和疫苗，病毒檢測(cè)技術(shù)普適性更強(qiáng)，看似更容易被攻克，但在具體應(yīng)用層面，仍面臨著許多個(gè)性的問題，如不同病毒的樣本獲取及核酸提取的差異、以及檢測(cè)結(jié)果的偏差等。對(duì)于冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)現(xiàn)狀如何，迅速推出的試劑盒是否意味著我們可以從容應(yīng)對(duì)一切突發(fā)病毒的檢測(cè)，以下將從專利大數(shù)據(jù)的角度，對(duì)我國及全球冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)發(fā)展?fàn)顩r進(jìn)行解讀，以期為應(yīng)對(duì)突發(fā)性疫情提供一些思路。
冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)屬于“事件主導(dǎo)型”研發(fā)
由圖1可以看出，2003年“非典”疫情到來之前，學(xué)術(shù)屆對(duì)于冠狀病毒的檢測(cè)并不十分關(guān)注，無論是蛋白檢測(cè)，還是核酸檢測(cè)，年均專利申請(qǐng)量在10件左右。而2013年SARS疫情席卷中國，冠狀病毒專利申請(qǐng)也出現(xiàn)了爆發(fā)式增長，達(dá)到了近200件。而當(dāng)疫情過后，專利申請(qǐng)量又呈現(xiàn)斷崖式下跌。直至2015年，中東呼吸綜合征（MERS）在韓國爆發(fā)，專利申請(qǐng)也相應(yīng)出現(xiàn)反彈，但由于有了上一次疫情中的技術(shù)積累，專利申請(qǐng)量也沒有增長太多。MERS疫情過后，相關(guān)專利申請(qǐng)量保持平穩(wěn)狀態(tài)。由于專利申請(qǐng)公開滯后，2018年后的專利申請(qǐng)量還不能反映實(shí)際數(shù)量，由于此次中國“新冠”疫情，預(yù)計(jì)2019-2020年的專利申請(qǐng)量還會(huì)出現(xiàn)一波增長。
在檢測(cè)對(duì)象方面，從下圖也可以注意到，2015年MERS疫情爆發(fā)之前，學(xué)界更多關(guān)注的是蛋白檢測(cè)。而MERS疫情是個(gè)分水嶺，之后核酸檢測(cè)便占據(jù)了主導(dǎo)地位。本次“新冠”事件中，中國藥監(jiān)局審批通過的7個(gè)試劑盒也清一色均為核酸檢測(cè)試劑盒。
冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)屬于小眾研發(fā)領(lǐng)域
2003年前，冠狀病毒檢測(cè)的研究由美國、日本及歐洲的一些國家主導(dǎo)，主要為基礎(chǔ)性研究，中國并未過多的參與其中，各國的申請(qǐng)量也很少。而2003年由于中國“非典”爆發(fā)，中國在冠狀病毒檢測(cè)方面的專利申請(qǐng)一躍成為全球第二，申請(qǐng)量占據(jù)全球的32%，僅次于美國，這對(duì)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)尚處于起步階段的中國來講實(shí)屬不易，顯示了中國學(xué)術(shù)界用科學(xué)打敗疫情的決心。與此同時(shí)，受“非典”影響，亞洲的中國臺(tái)灣、新加坡、中國香港等地區(qū)的專利申請(qǐng)量也躋身全球前列。“非典”過后，美國繼續(xù)領(lǐng)跑，但各國的申請(qǐng)量都出現(xiàn)了斷崖式下跌。雖然2004-2014這十年是分子生物學(xué)飛速發(fā)展的一段時(shí)期，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，而美國也是絕大多數(shù)核心技術(shù)的發(fā)源地，如二代測(cè)序、抗體技術(shù)、基因編輯技術(shù)等，但對(duì)于冠狀病毒檢測(cè)的研發(fā)，并沒有再出現(xiàn)過大幅的增長。2015年后，隨著各類平臺(tái)技術(shù)的不斷成熟，新技術(shù)的開發(fā)進(jìn)入平臺(tái)期，而隨著中國知識(shí)產(chǎn)權(quán)制度的不斷完善，研發(fā)主體專利保護(hù)意識(shí)的不斷增強(qiáng)，中國在各領(lǐng)域的專利申請(qǐng)量大幅增長，冠狀病毒檢測(cè)領(lǐng)域申請(qǐng)量也超越美國躍居全球首位。
放眼全球，美國長期處于研發(fā)領(lǐng)先地位。而由于前兩次冠狀病毒疫情均發(fā)生在亞洲，在2003年及之后后韓國和日本在病毒檢測(cè)領(lǐng)域的專利申請(qǐng)量也在大幅增長，處于全球前五的位置。從絕對(duì)申請(qǐng)量來看，申請(qǐng)量最高的2003年，最多的美國也只有85件專利申請(qǐng)，相對(duì)于動(dòng)輒年申請(qǐng)量上千件的腫瘤檢測(cè)領(lǐng)域，實(shí)在是鳳毛麟角?？梢?，冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)一直以來就屬于小眾研發(fā)領(lǐng)域。
美國在冠狀病毒檢測(cè)研發(fā)領(lǐng)域起步于上世紀(jì)80年代，起步較早，且由于掌握眾多核心平臺(tái)技術(shù)，在該領(lǐng)域的專利申請(qǐng)量長期領(lǐng)跑全球，直至2015年被中國超越。中國比美國起步晚了近20年，但由于“非典”事件，能夠在2年內(nèi)躍居全球申請(qǐng)量第二，并在此后十余年間一直保持了這個(gè)地位。日本同樣起步較早，且一直以來申請(qǐng)量保持平穩(wěn)。韓國和中國起步時(shí)間相同，各年度的申請(qǐng)量與日本相差不多，在10件上下。
研發(fā)主體見招拆招，曇花一現(xiàn)
2003年前，冠狀病毒的研究由美國主導(dǎo)，全球排名前五位的申請(qǐng)人也基本被美國申請(qǐng)主體占據(jù)。2003年，申請(qǐng)量前7位的申請(qǐng)人則均屬于亞洲，其中中國占據(jù)5席，中國香港和新加坡各占1席。2004-2014年，中、美、韓三國的申請(qǐng)主體排名全球前列。2015年后，中國不僅在總申請(qǐng)量上躍居全球首位，在申請(qǐng)人排名上全球前7位中有6位中國申請(qǐng)人，而這份排名中也出現(xiàn)了基因編輯技術(shù)核心專利持有者——布羅德研究所有限公司的身影，預(yù)示著新的病毒檢測(cè)技術(shù)橫空出世。
縱觀全球各個(gè)時(shí)期，并沒有任何申請(qǐng)人能夠長期穩(wěn)居前列，且每個(gè)時(shí)期排名靠前的申請(qǐng)人的專利申請(qǐng)數(shù)量也均是個(gè)位數(shù)，冠狀病毒檢測(cè)領(lǐng)域呈現(xiàn)百花齊放、“你方唱罷我登場(chǎng)”的態(tài)勢(shì)。這也顯示了冠狀病毒作為短時(shí)集中爆發(fā)式出現(xiàn)的病毒，并未引起任何一個(gè)研發(fā)主體對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行持續(xù)性的投入研究，更多的是見招拆招式的應(yīng)對(duì)式研究。
借力平臺(tái)技術(shù)的發(fā)展穩(wěn)步推陳出新
（1）2003年前——積銖累寸
早期的冠狀病毒檢測(cè)均是采用動(dòng)物病毒進(jìn)行的研究性開發(fā)。早在1983年，日本KACHIKU EISEI SHIKENJO JAPAN的專利申請(qǐng)JP1984218959A首次報(bào)道了牛冠狀病毒的抗體檢測(cè)方法。
2001-2002年，來自英國皇家獸醫(yī)學(xué)院及美國輝瑞公司的科學(xué)家在體外表達(dá)了犬冠狀病毒（WO2004011651A1）和貓冠狀病毒的S蛋白（US20020115064A1），并提出了基于酶聯(lián)免疫法檢測(cè)犬冠狀病毒和貓冠狀病毒的方法。
也是在2001年，美國密歇根州立大學(xué)的專利申請(qǐng)US20050239057A1較早地報(bào)道了采用多重RT-PCR / PCR方法檢測(cè)牛冠狀病毒的方法，自此開啟了冠狀病毒核酸檢測(cè)的大門。
（2）2003年——一觸即發(fā)
2003年，“非典”在中國爆發(fā)，這一年的專利申請(qǐng)達(dá)到了179項(xiàng)，其中核酸檢測(cè)89項(xiàng)，蛋白檢測(cè)104項(xiàng)，檢測(cè)技術(shù)方面也呈現(xiàn)多樣化，多種分子生物學(xué)前沿技術(shù)被提出應(yīng)用于冠狀病毒的檢測(cè)。
美國偉勝科技有限公司的專利US7629114首次提出通過將生理溶液引入結(jié)膜囊并收集排入口咽的灌溉來收集鼻咽標(biāo)本的方法以收集鼻咽細(xì)胞和分泌物以診斷病毒性上呼吸道感染，大大提高了獲取檢測(cè)樣本的便利性。
美國聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司的專利申請(qǐng)US20050100883A1報(bào)道了采用SARS冠狀病毒（SCoV）的膜糖蛋白（M），刺突糖蛋白（S）和核衣殼蛋白（N）作為包被抗原檢測(cè)SARS相關(guān)抗體的酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）方法。
日本榮研化學(xué)株式會(huì)社的專利申請(qǐng)WO2005001097A1提出了嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒高靈敏度且快速的檢測(cè)方法，其根據(jù)SARS冠狀病毒RNA聚合酶堿基序列設(shè)計(jì)引物，通過核酸擴(kuò)增法對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)。
美國基因耐克生物醫(yī)學(xué)制品有限公司的專利申請(qǐng)WO2005038039A2公開了可以進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的TempPCR方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列的敏感和特異性擴(kuò)增。
香港YEUNG WAH HIN ALEX的專利申請(qǐng)US20040229211A1公開了使用一種染料（MOD）的多重實(shí)時(shí)PCR的敏感診斷測(cè)試方法及其在嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）的應(yīng)用。
廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司的專利申請(qǐng)CN1453589A公開了基于抗原抗體反應(yīng)的膠體金層析法檢測(cè)SARS冠狀病毒抗原的試劑盒。
王虹的專利申請(qǐng)CN1455003A公開了分子信標(biāo)法檢測(cè)SARS冠狀病毒，適用于定性、定量檢測(cè)呼吸道分泌物、血清、病檢組織和各種排泄物等標(biāo)本中的SARS－Cov RNA。
（3）2004-2014年——風(fēng)平浪靜
從“非典”事件結(jié)束到MERS疫情到來前的2004-2014年間，分子生物學(xué)飛速發(fā)展，隨著抗體制備技術(shù)的不斷推陳出新以及二代測(cè)序時(shí)代的到來，冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)也隨著平臺(tái)技術(shù)的發(fā)展而不斷更新，但由于這個(gè)時(shí)期并無市場(chǎng)需求，專利申請(qǐng)多為探索性研究，集中于表位蛋白的分離表達(dá)以及對(duì)于病毒的高通量檢測(cè)的嘗試，涉及核酸檢測(cè)193項(xiàng)，蛋白檢測(cè)249項(xiàng)。
表位蛋白的成果分離表達(dá)即可用于病毒檢測(cè)，又可用于疫苗制備。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院的專利申請(qǐng)CN101085812A公開了一種SARS冠狀病毒多肽抗原，在臨床診斷中具有應(yīng)用價(jià)值。中國科學(xué)院武漢病毒研究所的專利申請(qǐng)CN101100680A公開了高效表達(dá)SARS冠狀病毒S蛋白的重組桿狀病毒CCTCC NO：V200703，在疾病診斷及疫苗生產(chǎn)等相關(guān)領(lǐng)域的重要應(yīng)用價(jià)值。美國人力資源與健康服務(wù)部的專利申請(qǐng)WO2005010034A1公開了來自病毒（SARS-CoV）的刺突蛋白，可用于治療和診斷。財(cái)團(tuán)法人國家衛(wèi)生研究院的專利申請(qǐng) WO2005103259A1公開了SARS-cov核衣殼蛋白表位。
二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使高通量核酸檢測(cè)成為可能，大大提高了核酸檢測(cè)的便利性。國家質(zhì)量檢驗(yàn)檢疫總局動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所的專利申請(qǐng)CN103205509A公開了采用懸浮芯片技術(shù)的13種呼吸道病毒高通量檢測(cè)方法，可對(duì)包括冠狀病毒SARS-CoV在內(nèi)的13中呼吸道病毒進(jìn)行高靈敏度、高通量的檢測(cè)。韓國基因特力株式會(huì)社的專利KR100625325B1公開了用于檢測(cè)SARS病毒的N蛋白的引物和探針組合物。中山大學(xué)的專利申請(qǐng)CN102732638A公開了人冠狀病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS一管多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法及其引物、探針和試劑盒，可實(shí)現(xiàn)對(duì)人冠狀病毒五種型別的一管多重檢測(cè)。
（4）2015年后——橫空出世
2015年，MERS疫情在韓國爆發(fā)。有了前期的技術(shù)積累，核酸檢測(cè)試劑盒得以迅速研制并應(yīng)用于臨床檢測(cè)，在病人的診斷方面可以說比“非典”時(shí)期有了很大的進(jìn)步。由于冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)的成熟，雖然疫情再次來襲，專利申請(qǐng)量也沒有出現(xiàn)大幅增長的情況。值得注意的是，2015年冠狀病毒檢測(cè)的專利申請(qǐng)人名單中，“布羅德研究所”的名字赫然在列。布羅德研究所的張鋒研究員是真核細(xì)胞基因編輯技術(shù)的創(chuàng)始人，推動(dòng)了基因編輯技術(shù)在2012年后飛速發(fā)展。布羅德研究所的專利申請(qǐng)WO2017040316A1的提出也正式宣告基因編輯技術(shù)登上了冠狀病毒檢測(cè)的舞臺(tái)。
結(jié)語
由以上分析可知，各國研發(fā)主體對(duì)于冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)并未投入很大的研發(fā)精力，技術(shù)發(fā)展更多借力于平臺(tái)技術(shù)的發(fā)展及與相關(guān)RNA病毒的檢測(cè)技術(shù)的相互借鑒而穩(wěn)步推進(jìn)。雖然本次“2019-coV”疫情中我們應(yīng)對(duì)迅速，核酸檢測(cè)試劑盒快馬加鞭的被研制、審批、生產(chǎn)，但這些“趕制”出的試劑盒在實(shí)際應(yīng)用中也是反響不一，通常需要幾個(gè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)才能獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果，造成了一定程度上的資源浪費(fèi)。
對(duì)于冠狀病毒這類偶發(fā)性病毒，若長期大量投入研發(fā)，勢(shì)必造成資源浪費(fèi)，同時(shí)由于其自身危害性極大，研發(fā)活動(dòng)也會(huì)受諸多限制，大面積鋪開研發(fā)是不現(xiàn)實(shí)的。但雖然其他RNA病毒的檢測(cè)方法具有可借鑒性，但畢竟也存在著冠狀病毒檢測(cè)中個(gè)性的問題，如由于樣本的獲取、運(yùn)輸、保存、引物特異性、檢測(cè)方法本身、試劑盒質(zhì)量控制等諸多因素造成的假陰、假陽性問題，又無法在短時(shí)間克服。因此，在未來的研發(fā)道路上，可采取合理分配研發(fā)資源，加強(qiáng)國際合作，必要時(shí)也可充分動(dòng)員民間力量，如成立病毒研究基金會(huì)等措施，對(duì)冠狀病毒核酸檢測(cè)中檢測(cè)樣本的獲取及質(zhì)量控制、引物特異性、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的完善、試劑盒質(zhì)量控制，以及抗原-抗體檢測(cè)方法中涉及的病毒蛋白的體外表達(dá)、抗體的制備等具體領(lǐng)域進(jìn)行有針對(duì)性的研究，為從容應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情做足技術(shù)儲(chǔ)備。
